Faleminderit që vizituat nature.com. Versioni i shfletuesit që po përdorni ka mbështetje të kufizuar CSS. Për përvojën më të mirë, ne rekomandojmë përdorimin e versionit më të fundit të shfletuesit (ose çaktivizimin e modalitetit të përputhshmërisë në Internet Explorer). Përveç kësaj, për të siguruar mbështetje të vazhdueshme, kjo faqe do të jetë pa stile dhe JavaScript.
Muskuli skeletor është një ind heterogjen i përbërë kryesisht nga miofibrile, të cilat tek njerëzit zakonisht klasifikohen në tre lloje: një "i ngadaltë" (tipi 1) dhe dy "të shpejtë" (tipet 2A dhe 2X). Megjithatë, heterogjeniteti midis dhe brenda llojeve tradicionale të miofibrileve mbetet i kuptuar dobët. Ne aplikuam qasje transkriptomike dhe proteomike në 1050 dhe 1038 miofibrile individuale nga vastus lateralis njerëzor, përkatësisht. Studimi proteomik përfshinte burra, dhe studimi transkriptomike përfshinte 10 burra dhe 2 gra. Përveç izoformave të zinxhirit të rëndë të miozinës, ne identifikuam proteinat metabolike, proteinat ribozomale dhe proteinat qelizore të bashkimit si burime të ndryshueshmërisë shumëdimensionale të intermiofibrileve. Për më tepër, pavarësisht identifikimit të grupeve të fibrave të ngadalta dhe të shpejta, të dhënat tona sugjerojnë që fibrat e tipit 2X janë fenotipikisht të padallueshme nga fibrat e tjera me tkurrje të shpejtë. Për më tepër, klasifikimi i bazuar në zinxhirin e rëndë të miozinës është i pamjaftueshëm për të përshkruar fenotipin e miofibrës në miopatitë nemalinike. Në përgjithësi, të dhënat tona sugjerojnë heterogjenitet shumëdimensional të miofibrave, me burime variacioni që shtrihen përtej izoformave të zinxhirit të rëndë të miozinës.
Heterogjeniteti qelizor është një tipar i natyrshëm i të gjitha sistemeve biologjike, duke i lejuar qelizat të specializohen për të përmbushur nevojat e ndryshme të indeve dhe qelizave.1 Pikëpamja tradicionale e heterogjenitetit të fibrave të muskujve skeletorë ka qenë se neuronet motorike përcaktojnë llojin e fibrave brenda një njësie motorike, dhe se lloji i fibrave (domethënë, tipi 1, tipi 2A dhe tipi 2X tek njerëzit) përcaktohet nga karakteristikat e izoformave të zinxhirit të rëndë të miozinës (MYH).2 Kjo fillimisht bazohej në paqëndrueshmërinë e tyre të pH ATPase,3,4 dhe më vonë në shprehjen e tyre molekulare të MYH.5 Megjithatë, me identifikimin dhe pranimin pasues të fibrave "të përziera" që bashkë-shprehin MYH të shumëfishta në përmasa të ndryshme, fibrat e muskujve skeletorë shihen gjithnjë e më shumë si një vazhdimësi sesa si lloje të dallueshme fibrash.6 Pavarësisht kësaj, fusha ende mbështetet shumë në MYH si klasifikuesi kryesor për klasifikimin e miofibrave, një pikëpamje që ka të ngjarë të ndikohet nga kufizimet dhe paragjykimet e rëndësishme të studimeve të hershme të brejtësve, profilet e shprehjes së MYH të të cilave dhe diapazoni i llojeve të fibrave ndryshojnë nga ato tek njerëzit.2 Situata ndërlikohet më tej nga fakti se muskujt e ndryshëm skeletorë të njeriut shfaqin një gamë të larmishme të llojeve të fibrave.7 vastus lateralis është një muskul i përzier me një profil të ndërmjetëm (dhe për këtë arsye përfaqësues) të shprehjes së MYH.7 Për më tepër, lehtësia e marrjes së mostrave e bën atë muskulin më të studiuar tek njerëzit.
Kështu, hetimi i paanshëm i diversitetit të fibrave të muskujve skeletorë duke përdorur mjete të fuqishme "omike" është kritik, por edhe sfidues, pjesërisht për shkak të natyrës shumëbërthamore të fibrave të muskujve skeletorë. Megjithatë, teknologjitë e transkriptomikës8,9 dhe proteomikës10 kanë pësuar një revolucion në ndjeshmëri në vitet e fundit për shkak të përparimeve të ndryshme teknologjike, duke lejuar analizën e muskujve skeletorë në rezolucion të një fibre të vetme. Si rezultat, është bërë përparim i rëndësishëm në karakterizimin e diversitetit të një fibre të vetme dhe përgjigjen e tyre ndaj stimujve atrofikë dhe plakjes11,12,13,14,15,16,17,18. Është e rëndësishme të theksohet se këto përparime teknologjike kanë zbatime klinike, duke lejuar karakterizim më të detajuar dhe të saktë të çrregullimit të shoqëruar me sëmundjen. Për shembull, patofiziologjia e miopatisë nemalinike, një nga sëmundjet më të zakonshme të trashëguara të muskujve (MIM 605355 dhe MIM 161800), është komplekse dhe konfuze.19,20 Prandaj, një karakterizim më i mirë i çrregullimit të fibrave të muskujve skeletorë mund të çojë në përparime të rëndësishme në kuptimin tonë të kësaj sëmundjeje.
Ne zhvilluam metoda për analizën transkriptomike dhe proteomike të fibrave të vetme të muskujve skeletorë të izoluara manualisht nga mostrat e biopsisë njerëzore dhe i aplikuam ato në mijëra fibra, duke na lejuar të hetojmë heterogjenitetin qelizor të fibrave të muskujve skeletorë njerëzorë. Gjatë kësaj pune, ne demonstruam fuqinë e fenotipizimit transkriptomike dhe proteomike të fibrave muskulore dhe identifikuam proteinat metabolike, ribozomale dhe qelizore të bashkimit si burime të rëndësishme të ndryshueshmërisë ndërfibërore. Për më tepër, duke përdorur këtë rrjedhë pune proteomike, ne karakterizuam rëndësinë klinike të miopatisë nematodike në fibrat e vetme të muskujve skeletorë, duke zbuluar një zhvendosje të koordinuar drejt fibrave jo-oksiduese të pavarura nga lloji i fibrës bazuar në MYH.
Për të hetuar heterogjenitetin e fibrave të muskujve skeletorë të njeriut, ne zhvilluam dy rrjedha pune për të mundësuar analizën e transkriptomave dhe proteomave të fibrave të vetme të muskujve skeletorë (Figura 1A dhe Figura plotësuese 1A). Ne zhvilluam dhe optimizuam disa hapa metodologjikë, nga ruajtja e mostrës dhe ruajtja e integritetit të ARN-së dhe proteinave deri te optimizimi i rendimentit për secilën qasje. Për analizën e transkriptomave, kjo u arrit duke futur barkode molekulare specifike për mostrën në hapin fillestar të transkriptimit të kundërt, duke lejuar që 96 fibra të bashkohen për përpunim efikas pasues. Sekuencimi më i thellë (±1 milion lexime për fibër) krahasuar me qasjet tradicionale me një qelizë të vetme pasuroi më tej të dhënat e transkriptomave.21 Për proteomikën, ne përdorëm një gradient të shkurtër kromatografik (21 minuta) të kombinuar me marrjen e të dhënave DIA-PASEF në një spektrometër mase timsTOF për të optimizuar thellësinë e proteomit duke ruajtur rendiment të lartë. 22,23 Për të hetuar heterogjenitetin e fibrave të shëndetshme të muskujve skeletorë, ne karakterizuam transkriptomet e 1,050 fibrave individuale nga 14 donatorë të rritur të shëndetshëm dhe proteomet e 1,038 fibrave nga 5 donatorë të rritur të shëndetshëm (Tabela Plotësuese 1). Në këtë punim, këto grupe të dhënash referohen përkatësisht si transkriptome dhe proteome me 1,000 fibra. Qasja jonë zbuloi një total prej 27,237 transkriptimesh dhe 2,983 proteinash në analizat transkriptomike dhe proteomike me 1,000 fibra (Figura 1A, Grupe të dhënash plotësuese 1-2). Pas filtrimit të grupeve të të dhënave transkriptomike dhe proteomike për >1,000 gjene të zbuluara dhe 50% vlera të vlefshme për fibër, analizat pasuese bioinformatike u kryen për 925 dhe 974 fibra në transkriptomë dhe proteomë, përkatësisht. Pas filtrimit, u zbuluan mesatarisht 4257 ± 1557 gjene dhe 2015 ± 234 proteina (mesatarja ± SD) për fibër, me ndryshueshmëri të kufizuar ndër-individuale (Figurat Plotësuese 1B–C, Setet e të Dhënave Plotësuese 3–4). Megjithatë, ndryshueshmëria brenda subjektit ishte më e theksuar në të gjithë pjesëmarrësit, ndoshta për shkak të ndryshimeve në rendimentin e ARN-së/proteinës midis fibrave me gjatësi dhe sipërfaqe të prerjes tërthore të ndryshme. Për shumicën e proteinave (>2000), koeficienti i variacionit ishte nën 20% (Figura Plotësuese 1D). Të dyja metodat lejuan kapjen e një game të gjerë dinamike të transkripteve dhe proteinave me nënshkrime shumë të shprehura të rëndësishme për tkurrjen e muskujve (p.sh., ACTA1, MYH2, MYH7, TNNT1, TNNT3) (Figurat Plotësuese 1E–F). Shumica e karakteristikave të identifikuara ishin të zakonshme midis të dhënave transkriptomike dhe proteomike (Figura Plotësuese 1G), dhe intensitetet mesatare UMI/LFQ të këtyre karakteristikave ishin mjaft të korreluara mirë (r = 0.52) (Figura Plotësuese 1H).
Fluksi i punës së transkriptomikës dhe proteomikës (krijuar me BioRender.com). BD Kurbat e diapazonit dinamik për MYH7, MYH2 dhe MYH1, dhe pragjet e llogaritura për caktimin e llojit të fibrave. E, F Shpërndarja e shprehjes së MYH nëpër fibra në grupet e të dhënave të transkriptomikës dhe proteomikës. G, H Grafikët e Përafrimit dhe Projeksionit të Diversitetit Uniform (UMAP) për transkriptomikët dhe proteomikën të ngjyrosur sipas llojit të fibrës së bazuar në MYH. I, J Grafikët e karakteristikave që tregojnë shprehjen e MYH7, MYH2 dhe MYH1 në grupet e të dhënave të transkriptomikës dhe proteomikës.
Fillimisht, ne vendosëm t'i caktojmë secilës fibër një lloj fibre të bazuar në MYH duke përdorur një qasje të optimizuar që shfrytëzon ndjeshmërinë e lartë dhe diapazonin dinamik të shprehjes së MYH në grupet e të dhënave omike. Studimet e mëparshme kanë përdorur pragje arbitrare për të etiketuar fibrat si tip 1 i pastër, tip 2A, tip 2X ose të përziera bazuar në një përqindje fikse të shprehjes së MYH-ve të ndryshme11,14,24. Ne përdorëm një qasje të ndryshme në të cilën shprehja e secilës fibër u rendit nga MYH-të që përdorëm për të tipizuar fibrat: MYH7, MYH2 dhe MYH1, që korrespondojnë përkatësisht me fibrat e tipit 1, tipit 2A dhe tipit 2X. Pastaj llogaritëm matematikisht pikën më të ulët të inflektimit të secilës kurbë që rezultoi dhe e përdorëm atë si një prag për të caktuar fibrat si pozitive (mbi pragun) ose negative (nën pragun) për secilën MYH (Figura 1B–D). Këto të dhëna tregojnë se MYH7 (Figura 1B) dhe MYH2 (Figura 1C) kanë profile më të dallueshme shprehjeje on/off në nivelin e ARN-së krahasuar me nivelin e proteinave. Në të vërtetë, në nivelin e proteinave, shumë pak fibra nuk shprehnin MYH7, dhe asnjë fibër nuk kishte 100% shprehje të MYH2. Më pas përdorëm pragje të paracaktuara shprehjeje për t'i caktuar llojeve të fibrave të bazuara në MYH të gjitha fibrave në secilin grup të dhënash. Për shembull, fibrat MYH7+/MYH2-/MYH1- iu caktuan tipit 1, ndërsa fibrat MYH7-/MYH2+/MYH1+ iu caktuan tipit të përzier 2A/2X (shih Tabelën Plotësuese 2 për përshkrim të plotë). Duke i bashkuar të gjitha fibrat, vumë re një shpërndarje jashtëzakonisht të ngjashme të llojeve të fibrave të bazuara në MYH si në nivelet e ARN-së (Figura 1E) ashtu edhe në ato të proteinave (Figura 1F), ndërsa përbërja relative e llojeve të fibrave të bazuara në MYH ndryshonte midis individëve, siç pritej (Figura Plotësuese 2A). Shumica e fibrave u klasifikuan ose si tipi 1 i pastër (34-35%) ose si tipi 2A (36-38%), megjithëse u zbulua edhe një numër i konsiderueshëm i fibrave të përziera të tipit 2A/2X (16-19%). Një ndryshim i habitshëm është se fibrat e pastra të tipit 2X mund të zbulohen vetëm në nivelin e ARN-së, por jo në nivelin e proteinave, duke sugjeruar që shprehja e shpejtë e MYH rregullohet të paktën pjesërisht në mënyrë pas transkriptimit.
Ne e validuam metodën tonë të tipizimit të fibrave MYH të bazuara në proteomikë duke përdorur blotting me pika të bazuara në antitrupa, dhe të dyja metodat arritën pajtueshmëri 100% në identifikimin e fibrave të pastra të tipit 1 dhe tipit 2A (shih Figurën Plotësuese 2B). Megjithatë, qasja e bazuar në proteomikë ishte më e ndjeshme, më efikase në identifikimin e fibrave të përziera dhe në përcaktimin sasior të proporcionit të secilit gjen MYH në secilën fibër. Këto të dhëna demonstrojnë efektivitetin e përdorimit të një qasje objektive dhe shumë të ndjeshme të bazuar në omikë për të karakterizuar llojet e fibrave të muskujve skeletorë.
Më pas përdorëm informacionin e kombinuar të ofruar nga transkriptomika dhe proteomika për të klasifikuar në mënyrë objektive miofibrat bazuar në transkriptomin ose proteomën e tyre të plotë. Duke përdorur metodën e përafrimit dhe projeksionit të shumëfishtë uniform (UMAP) për të zvogëluar dimensionalitetin në gjashtë komponentë kryesorë (Figurat Plotësuese 3A–B), ne ishim në gjendje të vizualizonim ndryshueshmërinë e miofibrës në transkriptom (Figura 1G) dhe proteomë (Figura 1H). Veçanërisht, miofibrat nuk u grupuan sipas pjesëmarrësve (Figurat Plotësuese 3C–D) ose ditëve të testimit (Figura Plotësuese 3E) as në grupet e të dhënave të transkriptomikës dhe as në ato të proteomikës, duke sugjeruar që ndryshueshmëria brenda subjektit në fibrat e muskujve skeletorë është më e lartë se ndryshueshmëria midis subjekteve. Në grafikun UMAP, dolën dy grupe të dallueshme që përfaqësojnë miofibra "të shpejta" dhe "të ngadalta" (Figurat 1G–H). Miofibrat MYH7+ (të ngadalta) u grumbulluan në polin pozitiv të UMAP1, ndërsa miofibrat MYH2+ dhe MYH1+ (të shpejta) u grumbulluan në polin negativ të UMAP1 (Figurat 1I-J). Megjithatë, nuk u bë dallim midis llojeve të fibrave me tkurrje të shpejtë (domethënë, tipi 2A, tipi 2X ose 2A/2X i përzier) bazuar në shprehjen e MYH, duke sugjeruar që shprehja e MYH1 (Figura 1I-J) ose shënuesve të tjerë klasikë të miofibrave 2X si ACTN3 ose MYLK2 (Figurat Plotësuese 4A-B) nuk bën dallim midis llojeve të ndryshme të miofibrave kur merret në konsideratë i gjithë transkriptomi ose proteoma. Për më tepër, krahasuar me MYH2 dhe MYH7, pak transkripte ose proteina ishin të lidhura pozitivisht me MYH1 (Fig. Plotësuese 4C-H), duke sugjeruar që bollëku i MYH1 nuk e pasqyron plotësisht transkriptomin/proteomën e miofibrës. Përfundime të ngjashme u arritën kur u vlerësua shprehja e përzier e tre izoformave MYH në nivelin UMAP (Fig. Plotësuese 4I–J). Kështu, ndërsa fibrat 2X mund të identifikohen në nivelin e transkriptit vetëm bazuar në kuantifikimin e MYH, fibrat MYH1+ nuk dallohen nga fibrat e tjera të shpejta kur merret në konsideratë i gjithë transkriptomi ose proteoma.
Si një eksplorim fillestar i heterogjenitetit të fibrave të ngadalta përtej MYH, ne vlerësuam katër proteina specifike të tipit të fibrave të ngadalta të përcaktuara: TPM3, TNNT1, MYL3 dhe ATP2A22. Nëntipet e fibrave të ngadalta treguan korrelacione të larta, megjithëse jo të përsosura, Pearson me MYH7 si në transkriptomi (Figura Plotësuese 5A) ashtu edhe në proteomikë (Figura Plotësuese 5B). Përafërsisht 25% dhe 33% e fibrave të ngadalta nuk u klasifikuan si fibra të ngadalta të pastra nga të gjitha nëntipet e gjeneve/proteinave në transkriptomi (Figura Plotësuese 5C) dhe proteomikë (Figura Plotësuese 5D), përkatësisht. Prandaj, klasifikimi i fibrave të ngadalta bazuar në nëntipe të shumta gjenesh/proteinash paraqet kompleksitet shtesë, madje edhe për proteinat që dihet se janë specifike për tipin e fibrave. Kjo sugjeron që klasifikimi i fibrave bazuar në izoformat e një familjeje të vetme gjenesh/proteinash mund të mos pasqyrojë në mënyrë adekuate heterogjenitetin e vërtetë të fibrave të muskujve skeletorë.
Për të eksploruar më tej ndryshueshmërinë fenotipike të fibrave të muskujve skeletorë të njeriut në shkallën e të gjithë modelit omik, ne kryem reduktimin e paanshëm të dimensionalitetit të të dhënave duke përdorur analizën kryesore të komponentëve (PCA) (Figura 2A). Ngjashëm me grafikët UMAP, as pjesëmarrësi dhe as dita e testimit nuk ndikuan në grupimin e fibrave në nivelin PCA (Figurat Plotësuese 6A-C). Në të dy grupet e të dhënave, lloji i fibrave të bazuara në MYH u shpjegua nga PC2, i cili tregoi një grupim fibrash të tipit 1 me tkurrje të ngadaltë dhe një grupim të dytë që përmbante fibra të tipit 2A me tkurrje të shpejtë, tipit 2X dhe fibra të përziera 2A/2X (Figura 2A). Në të dy grupet e të dhënave, këto dy grupe ishin të lidhura nga një numër i vogël fibrash të tipit 1/2A të përziera. Siç pritej, analiza e mbipërfaqësimit të nxitësve kryesorë të PC konfirmoi se PC2 drejtohej nga nënshkrimet kontraktile dhe metabolike (Figura 2B dhe Figurat Plotësuese 6D-E, Sete të të Dhënave Plotësuese 5-6). Në përgjithësi, lloji i fibrës me bazë MYH u gjet i mjaftueshëm për të shpjeguar ndryshimin e vazhdueshëm përgjatë PC2, me përjashtim të të ashtuquajturave fibra 2X që u shpërndanë në të gjithë transkriptomin brenda grumbullit të shpejtë.
A. Grafikët e analizës kryesore të komponentëve (PCA) të grupeve të të dhënave të transkriptomit dhe proteomit të ngjyrosur sipas llojit të fibrës bazuar në MYH. B. Analiza e pasurimit të nxitësve të transkriptit dhe proteinave në PC2 dhe PC1. Analiza statistikore u krye duke përdorur paketën clusterProfiler dhe vlerat p të rregulluara nga Benjamini-Hochberg. C, D. Grafikët PCA të ngjyrosur sipas termave të ontologjisë së gjenit të aderimit ndërqelizor (GO) në termat GO të transkriptomit dhe kostomerit në proteom. Shigjetat përfaqësojnë nxitësit e transkriptit dhe proteinave dhe drejtimet e tyre. E, F. Grafikët e karakteristikave të përafrimit dhe projeksionit të shumëfishtë uniform (UMAP) të karakteristikave klinikisht të rëndësishme që tregojnë gradiente shprehjeje të pavarura nga lloji i fibrës së ngadaltë/të shpejtë. G, H. Korrelacionet midis nxitësve PC2 dhe PC1 në transkriptome dhe proteoma.
Papritur, lloji i miofibrës me bazë MYH shpjegoi vetëm shkallën e dytë më të lartë të ndryshueshmërisë (PC2), duke sugjeruar që faktorë të tjerë biologjikë që nuk lidhen me llojin e miofibrës me bazë MYH (PC1) luajnë një rol të rëndësishëm në rregullimin e heterogjenitetit të fibrave të muskujve skeletorë. Analiza e mbipërfaqësimit të faktorëve kryesorë në PC1 zbuloi se ndryshueshmëria në PC1 përcaktohej kryesisht nga ngjitja qelizë-qelizë dhe përmbajtja e ribozomës në transkriptomë, dhe kostomeret dhe proteinat ribozomale në proteomë (Figura 2B dhe Figurat Plotësuese 6D–E, Seti i të Dhënave Plotësuese 7). Në muskujt skeletorë, kostomeret lidhin diskun Z me sarkolemën dhe janë të përfshira në transmetimin dhe sinjalizimin e forcës. 25 Grafikët PCA të shënuar duke përdorur karakteristikat e ngjitjes qelizë-qelizë (transkritoma, Figura 2C) dhe kostomerës (proteoma, Figura 2D) zbuluan një zhvendosje të fortë majtas në PC1, duke treguar se këto karakteristika janë të pasuruara në fibra të caktuara.
Një shqyrtim më i detajuar i grumbullimit të miofibrave në nivelin UMAP zbuloi se shumica e karakteristikave shfaqnin një gradient shprehjeje të bazuar në MYH të pavarur nga lloji i miofibrës, në vend që të ishte specifik për nëngrupimin e miofibrës. Kjo vazhdimësi u vu re për disa gjene të shoqëruara me gjendje patologjike (Figura 2E), të tilla si CHCHD10 (sëmundje neuromuskulare), SLIT3 (atrofi muskulore), CTDNEP1 (sëmundje muskulore). Kjo vazhdimësi u vu re gjithashtu në të gjithë proteomën, duke përfshirë proteinat e shoqëruara me çrregullime neurologjike (UGDH), sinjalizimin e insulinës (PHIP) dhe transkriptimin (HIST1H2AB) (Figura 2F). Së bashku, këto të dhëna tregojnë vazhdimësi në heterogjenitetin e tkurrjes së ngadaltë/të shpejtë të pavarur nga lloji i fibrave në miofibra të ndryshme.
Është interesante që gjenet nxitëse në PC2 treguan korrelacion të mirë transkriptomë-proteomë (r = 0.663) (Figura 2G), duke sugjeruar që llojet e fibrave me tkurrje të ngadaltë dhe të shpejtë, dhe në veçanti vetitë kontraktile dhe metabolike të fibrave të muskujve skeletorë, rregullohen në mënyrë transkriptive. Megjithatë, gjenet nxitëse në PC1 nuk treguan korrelacion transkriptomë-proteomë (r = -0.027) (Figura 2H), duke sugjeruar që variacionet që nuk lidhen me llojet e fibrave me tkurrje të ngadaltë/të shpejtë rregullohen kryesisht pas transkriptimit. Meqenëse variacionet në PC1 u shpjeguan kryesisht nga termat e ontologjisë së gjeneve ribozomale, dhe duke pasur parasysh që ribozomet luajnë një rol vendimtar dhe të specializuar në qelizë duke marrë pjesë aktive dhe duke ndikuar në përkthimin e proteinave,31 ne më pas nisëm të hetojmë këtë heterogjenitet të papritur ribozomal.
Së pari, ne ngjyrosëm grafikun e analizës së komponentëve kryesorë të proteomikës sipas bollëkut relativ të proteinave në termin GOCC "ribozom citoplazmatik" (Figura 3A). Edhe pse ky term është i pasuruar në anën pozitive të PC1, duke rezultuar në një gradient të vogël, proteinat ribozomale nxisin ndarjen në të dy drejtimet e PC1 (Figura 3A). Proteinat ribozomale të pasuruara në anën negative të PC1 përfshinin RPL18, RPS18 dhe RPS13 (Figura 3B), ndërsa RPL31, RPL35 dhe RPL38 (Figura 3C) ishin nxitësit kryesorë në anën pozitive të PC1. Është interesante se RPL38 dhe RPS13 u shprehën shumë në muskujt skeletorë krahasuar me indet e tjera (Figura Plotësuese 7A). Këto nënshkrime dalluese ribozomale në PC1 nuk u vunë re në transkriptom (Figura Plotësuese 7B), duke treguar rregullim pas transkriptimit.
A. Grafiku i analizës së komponentëve kryesorë (PCA) i ngjyrosur sipas termave të ontologjisë së gjenit ribozomal citoplazmatik (GO) në të gjithë proteomën. Shigjetat tregojnë drejtimin e variacionit të ndërmjetësuar nga proteina në grafikun PCA. Gjatësia e vijës korrespondon me rezultatin e komponentëve kryesorë për një proteinë të caktuar. B, C. Grafikët e karakteristikave PCA për RPS13 dhe RPL38. D. Analiza e pambikëqyrur e grupimit hierarkik të proteinave ribozomale citoplazmatike. E. Modeli strukturor i ribozomës 80S (PDB: 4V6X) që nxjerr në pah proteinat ribozomale me bollëk të ndryshëm në fibrat e muskujve skeletorë. F. Proteina ribozomale me stekiometri të ndryshme të lokalizuara pranë kanalit të daljes së mRNA-së.
Konceptet e heterogjenitetit dhe specializimit të ribozomeve janë propozuar më parë, ku prania e nënpopullatave të dallueshme të ribozomeve (heterogjeniteti i ribozomeve) mund të ndikojë drejtpërdrejt në përkthimin e proteinave në inde dhe qeliza të ndryshme32 dhe33 përmes përkthimit selektiv të grupeve specifike të transkripteve të mRNA-së34 (specializimi i ribozomeve). Për të identifikuar nënpopullatat e proteinave ribozomale të bashkë-shprehura në fibrat e muskujve skeletorë, ne kryem një analizë të pambikëqyrur të grupimit hierarkik të proteinave ribozomale në proteomë (Figura 3D, Seti i të Dhënave Plotësuese 8). Siç pritej, proteinat ribozomale nuk u grupuan sipas llojit të fibrës bazuar në MYH. Megjithatë, ne identifikuam tre grupe të dallueshme të proteinave ribozomale; grupi i parë (grupi_ribosomal_1) është i koreguluar me RPL38 dhe për këtë arsye ka shprehje të rritur në fibra me një profil pozitiv PC1. Grupi i dytë (grupi_ribosomal_2) është i koreguluar me RPS13 dhe është i ngritur në fibra me një profil negativ PC1. Grumbulli i tretë (ribosomal_cluster_3) nuk tregon shprehje diferenciale të koordinuar në fibrat e muskujve skeletorë dhe mund të konsiderohet proteina ribozomale "thelbësore" e muskujve skeletorë. Të dy grumbujt ribozomalë 1 dhe 2 përmbajnë proteina ribozomale që më parë janë treguar se rregullojnë përkthimin alternativ (p.sh., RPL10A, RPL38, RPS19 dhe RPS25) dhe ndikojnë funksionalisht në zhvillim (p.sh., RPL10A, RPL38).34,35,36,37,38 Në përputhje me rezultatet e PCA, përfaqësimi heterogjen i vëzhguar i këtyre proteinave ribozomale nëpër fibra tregoi gjithashtu vazhdimësi (Figura Plotësuese 7C).
Për të vizualizuar vendndodhjen e proteinave heterogjene ribozomale brenda ribozomës, ne përdorëm një model strukturor të ribozomës njerëzore 80S (Protein Data Bank: 4V6X) (Figura 3E). Pas izolimit të proteinave ribozomale që i përkisnin grumbujve të ndryshëm ribozomale, vendndodhjet e tyre nuk ishin të lidhura ngushtë, duke sugjeruar që qasja jonë dështoi të siguronte pasurim për rajone/fraksione të caktuara të ribozomës. Megjithatë, është interesante se përqindja e proteinave të nënnjësive të mëdha në grumbullin 2 ishte më e ulët se në grumbujt 1 dhe 3 (Figura Plotësuese 7D). Ne vumë re se proteinat me stekiometri të ndryshuar në fibrat e muskujve skeletorë ishin kryesisht të lokalizuara në sipërfaqen e ribozomës (Figura 3E), në përputhje me aftësinë e tyre për të bashkëvepruar me elementët e vendit të hyrjes së brendshme të ribozomës (IRES) në popullata të ndryshme të mRNA-së, duke koordinuar kështu përkthimin selektiv. 40, 41 Për më tepër, shumë proteina me stekiometri të ndryshuar në fibrat e muskujve skeletorë ishin të vendosura pranë rajoneve funksionale siç është tuneli i daljes së mRNA-së (Figura 3F), të cilat rregullojnë në mënyrë selektive zgjatjen përkthimore dhe ndalimin e peptideve specifike. 42 Si përmbledhje, të dhënat tona sugjerojnë që stekiometria e proteinave ribozomale të muskujve skeletorë shfaq heterogjenitet, duke rezultuar në ndryshime midis fibrave të muskujve skeletorë.
Më pas, ne nisëm të identifikojmë nënshkrimet e fibrave me tkurrje të shpejtë dhe të ngadaltë dhe të eksplorojmë mekanizmat e rregullimit të tyre transkriptues. Duke krahasuar grupet e fibrave me tkurrje të shpejtë dhe të ngadaltë të përcaktuara nga UMAP në dy grupet e të dhënave (Figurat 1G–H dhe 4A–B), analizat transkriptomike dhe proteomike identifikuan përkatësisht 1366 dhe 804 karakteristika me bollëk të ndryshëm (Figurat 4A–B, Grupet e të Dhënave Plotësuese 9–12). Ne vëzhguam ndryshimet e pritura në nënshkrimet që lidhen me sarkomeret (p.sh., tropomiozina dhe troponina), çiftëzimin e ngacmim-tkurrje (izoformat SERCA) dhe metabolizmin e energjisë (p.sh., ALDOA dhe CKB). Për më tepër, transkriptet dhe proteinat që rregullojnë ubikuitinimin e proteinave u shprehën në mënyrë të ndryshme në fibrat me tkurrje të shpejtë dhe të ngadaltë (p.sh., USP54, SH3RF2, USP28 dhe USP48) (Figurat 4A–B). Për më tepër, gjeni i proteinës mikrobike RP11-451G4.2 (DWORF), i cili më parë është treguar se shprehet në mënyrë të ndryshme në të gjitha llojet e fibrave muskulore të qengjit43 dhe rrit aktivitetin SERCA në muskulin kardiak44, u rrit ndjeshëm në fibrat e ngadalta të muskujve skeletorë (Figura 4A). Në mënyrë të ngjashme, në nivelin individual të fibrave, u vunë re ndryshime të rëndësishme në nënshkrimet e njohura siç janë izoformat e laktat dehidrogjenazës të lidhura me metabolizmin (LDHA dhe LDHB, Figura 4C dhe Figura plotësuese 8A)45,46 si dhe nënshkrimet specifike të tipit të fibrave të panjohura më parë (si IRX3, USP54, USP28 dhe DPYSL3) (Figura 4C). Kishte një mbivendosje të konsiderueshme të karakteristikave të shprehura në mënyrë të ndryshme midis të dhënave transkriptomike dhe proteomike (Figura plotësuese 8B), si dhe një korrelacion të ndryshimit të palosjes të nxitur kryesisht nga shprehja më e theksuar diferenciale e karakteristikave të sarkomerit (Figura plotësuese 8C). Veçanërisht, disa nënshkrime (p.sh. USP28, USP48, GOLGA4, AKAP13) treguan rregullim të fortë pas transkriptimit vetëm në nivelin proteomik dhe kishin profile shprehjeje specifike për llojin e fibrave me tkurrje të ngadaltë/të shpejtë (Figura Plotësuese 8C).
Grafikët e vullkanit A dhe B që krahasojnë grumbujt e ngadaltë dhe të shpejtë të identifikuar nga grafikët e përafrimit dhe projeksionit të shumëfishtë uniform (UMAP) në Figurat 1G–H. Pikat me ngjyra përfaqësojnë transkriptet ose proteinat që janë dukshëm të ndryshme në FDR < 0.05, dhe pikat më të errëta përfaqësojnë transkriptet ose proteinat që janë dukshëm të ndryshme në ndryshimin logaritmik > 1. Analiza statistikore dypalëshe u krye duke përdorur testin DESeq2 Wald me vlera p të rregulluara nga Benjamini-Hochberg (transcriptomics) ose metodën e modelit linear Limma me analizë empirike Bayesian të ndjekur nga rregullimi Benjamini-Hochberg për krahasime të shumëfishta (proteomics). C Grafikët e nënshkrimit të gjeneve ose proteinave të zgjedhura të shprehura në mënyrë të ndryshme midis fibrave të ngadalta dhe të shpejta. D Analiza e pasurimit të transkripteve dhe proteinave të shprehura në mënyrë të konsiderueshme në mënyrë të ndryshme. Vlerat mbivendosëse pasurohen në të dy grupet e të dhënave, vlerat e transkriptomeve pasurohen vetëm në transkriptom, dhe vlerat e proteomeve pasurohen vetëm në proteom. Analiza statistikore u krye duke përdorur paketën clusterProfiler me vlera p të rregulluara nga Benjamini-Hochberg. E. Faktorët e transkriptimit specifikë për llojin e fibrave të identifikuar nga SCENIC bazuar në rezultatet e specifikës së rregullatorit të derivuar nga SCENIC dhe shprehjen diferenciale të mRNA-së midis llojeve të fibrave. F. Profilizimi i faktorëve të zgjedhur të transkriptimit të shprehur në mënyrë të ndryshme midis fibrave të ngadalta dhe të shpejta.
Pastaj kryem një analizë të mbipërfaqësimit të gjeneve dhe proteinave të përfaqësuara në mënyrë të ndryshme (Figura 4D, Seti i të Dhënave Plotësuese 13). Pasurimi i rrugëve për karakteristikat që ndryshonin midis dy seteve të të dhënave zbuloi ndryshime të pritura, të tilla si proceset e β-oksidimit të acideve yndyrore dhe metabolizmit të ketoneve (fibra të ngadalta), tkurrja e miofilamentit/muskulit (fibra të shpejta dhe të ngadalta, përkatësisht) dhe proceset katabolike të karbohidrateve (fibra të shpejta). Aktiviteti i fosfatazës së proteinave serinë/treoninë u rrit gjithashtu në fibrat e shpejta, i nxitur nga karakteristika të tilla si nënnjësitë rregullatore dhe katalitike të fosfatazës (PPP3CB, PPP1R3D dhe PPP1R3A), të cilat dihet se rregullojnë metabolizmin e glikogjenit (47) (Figurat Plotësuese 8D–E). Shtigje të tjera të pasuruara me fibra të shpejta përfshinin trupa përpunues (P-) (YTHDF3, TRIM21, LSM2) në proteom (Fig. plotësuese 8F), potencialisht të përfshirë në rregullimin post-transkriptues (48), dhe aktivitetin e faktorit të transkriptimit (SREBF1, RXRG, RORA) në transkriptom (Fig. plotësuese 8G). Fibrat e ngadalta u pasuruan në aktivitetin e oksidoreduktazës (BDH1, DCXR, TXN2) (Fig. plotësuese 8H), lidhjen e amideve (CPTP, PFDN2, CRYAB) (Fig. plotësuese 8I), matricën jashtëqelizore (CTSD, ADAMTSL4, LAMC1) (Fig. plotësuese 8J) dhe aktivitetin e receptorit-ligandit (FNDC5, SPX, NENF) (Fig. plotësuese 8K).
Për të fituar më shumë njohuri mbi rregullimin transkriptues që qëndron në themel të karakteristikave të tipit të fibrave muskulore të ngadalta/të shpejta, ne kryem analizën e pasurimit të faktorëve të transkriptimit duke përdorur SCENIC49 (Seti i të Dhënave Plotësuese 14). Shumë faktorë transkriptimi u pasuruan ndjeshëm midis fibrave muskulore të shpejta dhe të ngadalta (Figura 4E). Kjo përfshinte faktorë transkriptimi si MAFA, i cili më parë është lidhur me zhvillimin e shpejtë të fibrave muskulore,50 si dhe disa faktorë transkriptimi që nuk ishin të lidhur më parë me programet e gjeneve specifike të tipit të fibrave muskulore. Midis këtyre, PITX1, EGR1 dhe MYF6 ishin faktorët më të pasuruar të transkriptimit në fibrat muskulore të shpejta (Figura 4E). Në të kundërt, ZSCAN30 dhe EPAS1 (i njohur edhe si HIF2A) ishin faktorët më të pasuruar të transkriptimit në fibrat muskulore të ngadalta (Figura 4E). Në përputhje me këtë, MAFA u shpreh në nivele më të larta në rajonin UMAP që korrespondon me fibrat muskulore të shpejta, ndërsa EPAS1 kishte modelin e kundërt të shprehjes (Figura 4F).
Përveç gjeneve të njohura që kodojnë proteinat, ekzistojnë biotipe të shumta të ARN-së jo-koduese që mund të përfshihen në rregullimin e zhvillimit dhe sëmundjeve njerëzore. 51, 52 Në grupet e të dhënave të transkriptomave, disa ARN jo-koduese shfaqin specifikë të llojit të fibrave (Figura 5A dhe Seti i të Dhënave Plotësuese 15), duke përfshirë LINC01405, i cili është shumë specifik për fibrat e ngadalta dhe raportohet të jetë i zvogëluar në muskuj nga pacientët me miopati mitokondriale. 53 Në të kundërt, RP11-255P5.3, që korrespondon me gjenin lnc-ERCC5-5 (https://lncipedia.org/db/transcript/lnc-ERCC5-5:2) 54, shfaq specifikë të shpejtë të llojit të fibrave. Si LINC01405 (https://tinyurl.com/x5k9wj3h) ashtu edhe RP11-255P5.3 (https://tinyurl.com/29jmzder) shfaqin specifikë të muskujve skeletorë (Figurat Plotësuese 9A–B) dhe nuk kanë gjene kontraktile të njohura brenda lagjes së tyre gjenomike 1 Mb, duke sugjeruar që ato luajnë një rol të specializuar në rregullimin e llojeve të fibrave në vend që të rregullojnë gjenet kontraktile fqinje. Profilet e shprehjes specifike të tipit të fibrave të ngadalta/të shpejta të LINC01405 dhe RP11-255P5.3, përkatësisht, u konfirmuan duke përdorur RNAscope (Figurat 5B–C).
A. Transkriptet e ARN-së jo-koduese rregullohen në mënyrë të konsiderueshme në fibrat muskulore me tkurrje të ngadaltë dhe të shpejtë. B. Imazhe përfaqësuese të RNAscope që tregojnë specifikën e tipit të fibrave me tkurrje të ngadaltë dhe të shpejtë të LINC01405 dhe RP11-255P5.3, përkatësisht. Shiriti i shkallës = 50 μm. C. Përcaktimi sasior i shprehjes së ARN-së jo-koduese specifike për tipin e miofibrës, siç përcaktohet nga RNAscope (n = 3 biopsi nga individë të pavarur, duke krahasuar fibrat muskulore të shpejta dhe të ngadalta brenda secilit individ). Analiza statistikore u krye duke përdorur një test t të Studentit me dy bishta. Grafikët me kuti tregojnë medianën dhe kuartilet e para dhe të treta, me mustaqe që tregojnë vlerat minimale dhe maksimale. D. Fluksi i punës së identifikimit të proteinave mikrobike de novo (krijuar me BioRender.com). E. Proteina mikrobike LINC01405_ORF408:17441:17358 shprehet posaçërisht në fibrat muskulore skeletore të ngadalta (n = 5 biopsi nga pjesëmarrës të pavarur, duke krahasuar fibrat muskulore të shpejta dhe të ngadalta në secilin pjesëmarrës). Analiza statistikore u krye duke përdorur metodën e modelit linear Limm të kombinuar me një qasje empirike Bayesian, e ndjekur nga metoda Benjamini-Hochberg për krahasime të shumëfishta me rregullimin e vlerës p. Grafikët në formë kutie tregojnë medianën, kuartilet e para dhe të treta, me unaza që tregojnë vlerat maksimale/minimale.
Kohët e fundit, studimet kanë treguar se shumë transkripte të supozuara jo-koduese kodojnë proteina mikrobike të transkriptuara, disa prej të cilave rregullojnë funksionin e muskujve. 44, 55 Për të identifikuar proteinat mikrobike me specifikë të mundshme të llojit të fibrave, ne kërkuam në të dhënat tona të proteomeve me 1000 fibra duke përdorur një skedar FASTA të personalizuar që përmbante sekuencat e transkripteve jo-koduese (n = 305) të gjetura në të dhënat e transkripteve me 1000 fibra (Figura 5D). Ne identifikuam 197 proteina mikrobike nga 22 transkripte të ndryshme, 71 prej të cilave ishin të rregulluara në mënyrë të ndryshme midis fibrave të ngadalta dhe të shpejta të muskujve skeletorë (Figura Plotësuese 9C dhe Seti i të Dhënave Plotësuese 16). Për LINC01405, u identifikuan tre produkte proteinash mikrobike, njëri prej të cilëve tregoi specifikë të ngjashme të fibrave të ngadalta me transkriptin e tij (Figura 5E dhe Figura Plotësuese 9D). Kështu, ne identifikuam LINC01405 si një gjen që kodon një proteinë mikrobike specifike për fibrat e ngadalta të muskujve skeletorë.
Ne zhvilluam një rrjedhë pune gjithëpërfshirëse për karakterizimin proteomik në shkallë të gjerë të fibrave individuale muskulore dhe identifikuam rregullatorët e heterogjenitetit të fibrave në gjendje të shëndetshme. Ne e aplikuam këtë rrjedhë pune për të kuptuar se si miopatitë nemalinike ndikojnë në heterogjenitetin e fibrave të muskujve skeletorë. Miopatitë nemalinike janë sëmundje të trashëguara të muskujve që shkaktojnë dobësi të muskujve dhe, tek fëmijët e prekur, paraqiten me një sërë ndërlikimesh duke përfshirë vështirësi në frymëmarrje, skoliozë dhe lëvizshmëri të kufizuar të gjymtyrëve. 19,20 Në mënyrë tipike, në miopatitë nemalinike, variantet patogjene në gjenet si aktina alfa 1 (ACTA1) rezultojnë në një mbizotërim të përbërjes së miofibrës së fibrave me tkurrje të ngadaltë, megjithëse ky efekt është heterogjen. Një përjashtim i dukshëm është miopatia nemalinike e troponinës T1 (TNNT1), e cila ka një mbizotërim të fibrave të shpejta. Kështu, një kuptim më i mirë i heterogjenitetit që qëndron në themel të çrregullimit të fibrave të muskujve skeletorë të vërejtur në miopatitë nemalinike mund të ndihmojë në zbardhjen e marrëdhënies komplekse midis këtyre sëmundjeve dhe llojit të miofibrës.
Krahasuar me kontrollet e shëndetshme (n = 3 për grup), miofibrat e izoluara nga pacientët me miopati nemaline me mutacione në gjenet ACTA1 dhe TNNT1 treguan atrofi ose distrofi të theksuar të miofibrës (Figura 6A, Tabela Plotësuese 3). Kjo paraqiti sfida të rëndësishme teknike për analizën proteomike për shkak të sasisë së kufizuar të materialit në dispozicion. Pavarësisht kësaj, ne ishim në gjendje të zbulonim 2485 proteina në 272 miofibra skeletore. Pas filtrimit për të paktën 1000 proteina të kuantifikuara për fibër, 250 fibra iu nënshtruan analizës pasuese bioinformatike. Pas filtrimit, një mesatare prej 1573 ± 359 proteinash për fibër u kuantifikuan (Figura Plotësuese 10A, Sete të Dhënash Plotësuese 17-18). Veçanërisht, pavarësisht reduktimit të ndjeshëm të madhësisë së fibrave, thellësia e proteomës së mostrave të pacientëve me miopati nemaline u ul vetëm pak. Për më tepër, përpunimi i këtyre të dhënave duke përdorur skedarët tanë FASTA (duke përfshirë transkriptet jo-koduese) na lejoi të identifikonim pesë proteina mikrobike në miofibrat skeletore nga pacientët me miopati nemaline (Seti i të Dhënave Plotësuese 19). Diapazoni dinamik i proteomës ishte dukshëm më i gjerë, dhe proteinat totale në grupin e kontrollit korreloheshin mirë me rezultatet e një analize të mëparshme të proteomës me 1000 fibra (Fig. Plotësuese 10B–C).
A. Imazhe mikroskopike që tregojnë atrofi ose distrofi të fibrave dhe mbizotërimin e llojeve të ndryshme të fibrave bazuar në MYH në miopatitë nemalinike (NM) ACTA1 dhe TNNT1. Shiriti i shkallës = 100 μm. Për të siguruar riprodhueshmërinë e ngjyrosjes në pacientët me ACTA1 dhe TNNT1, tre biopsi të pacientëve u ngjyrosën dy deri në tre herë (katër seksione për rast) para se të zgjidheshin imazhe përfaqësuese. B. Proporcionet e llojeve të fibrave në pjesëmarrës bazuar në MYH. C. Grafiku i analizës kryesore të komponentëve (PCA) të fibrave të muskujve skeletorë në pacientët me miopati nemalinike dhe kontrollet. D. Fibrat e muskujve skeletorë nga pacientët me miopati nemalinike dhe kontrollet e projektuara në një grafik PCA të përcaktuar nga 1000 fibrat e analizuara në Figurën 2. Për shembull, grafikët e vullkanit që krahasojnë ndryshimet midis pjesëmarrësve me miopati nemalinike ACTA1 dhe TNNT1 dhe kontrollet, dhe midis pjesëmarrësve me miopati nemalinike ACTA1 dhe TNNT1. Rrathët me ngjyra tregojnë proteinat që ishin dukshëm të ndryshme në π < 0.05, dhe pikat e errëta tregojnë proteinat që ishin dukshëm të ndryshme në FDR < 0.05. Analiza statistikore u krye duke përdorur metodën e modelit linear Limma dhe metodat empirike Bayesian, e ndjekur nga rregullimi i vlerës p për krahasime të shumëfishta duke përdorur metodën Benjamini-Hochberg. H. Analiza e pasurimit të proteinave të shprehura në mënyrë të konsiderueshme në të gjithë proteomën dhe në fibrat e tipit 1 dhe 2A. Analiza statistikore u krye duke përdorur paketën clusterProfiler dhe vlerat p të rregulluara nga Benjamini-Hochberg. I, J. Grafikët e analizës kryesore të komponentëve (PCA) të ngjyrosura sipas termave të matricës jashtëqelizore dhe ontologjisë së gjenit mitokondrial (GO).
Meqenëse miopatitë nemalinike mund të ndikojnë në përqindjen e llojeve të miofibrave që shprehin MYH në muskujt skeletorë,19,20 ne së pari shqyrtuam llojet e miofibrave që shprehin MYH tek pacientët me miopati nemalinike dhe kontrollet. Ne përcaktuam llojin e miofibrave duke përdorur një metodë të paanshme të përshkruar më parë për analizën 1000 miofibrash (Fig. Plotësuese 10D-E) dhe përsëri dështuam të identifikonim miofibra të pastra 2X (Figura 6B). Ne vumë re një efekt heterogjen të miopative nemalinike në llojin e miofibrave, pasi dy pacientë me mutacione ACTA1 kishin një përqindje të rritur të miofibrave të tipit 1, ndërsa dy pacientë me miopati nemalinike TNNT1 kishin një përqindje të zvogëluar të miofibrave të tipit 1 (Figura 6B). Në të vërtetë, shprehja e MYH2 dhe izoformave të troponinës së shpejtë (TNNC2, TNNI2 dhe TNNT3) u ul në miopatitë ACTA1-nemalinë, ndërsa shprehja e MYH7 u ul në miopatitë TNNT1-nemalinë (Figura plotësuese 11A). Kjo është në përputhje me raportet e mëparshme të ndërrimit heterogjen të tipit të miofibrës në miopatitë nemalinë.19,20 Ne i konfirmuam këto rezultate me anë të imunohistokimisë dhe zbuluam se pacientët me miopati ACTA1-nemalinë kishin një mbizotërim të miofibrave të tipit 1, ndërsa pacientët me miopati TNNT1-nemalinë kishin modelin e kundërt (Figura 6A).
Në nivelin e proteomit me një fibër të vetme, fibrat muskulore skeletore nga pacientët me miopati nemalinike ACTA1 dhe TNNT1 u grupuan me shumicën e fibrave të kontrollit, me fibrat e miopatisë nemalinike TNNT1 që në përgjithësi ishin më të prekurat rëndë (Figura 6C). Kjo ishte veçanërisht e dukshme kur u ndërtuan grafikët e analizës kryesore të komponentëve (PCA) të fibrave pseudo-të fryra për secilin pacient, me pacientët 2 dhe 3 me miopati nemalinike TNNT1 që dukeshin më larg nga mostrat e kontrollit (Figura plotësuese 11B, Seti i të Dhënave plotësuese 20). Për të kuptuar më mirë se si fibrat nga pacientët me miopati krahasohen me fibrat e shëndetshme, ne përdorëm informacion të detajuar të marrë nga analiza proteomike e 1,000 fibrave nga pjesëmarrës të rritur të shëndetshëm. Ne projektuam fibra nga seti i të dhënave të miopatisë (pacientët me miopati nemalinike ACTA1 dhe TNNT1 dhe kontrollet) në grafikun PCA të marrë nga analiza proteomike me 1000 fibra (Figura 6D). Shpërndarja e llojeve të fibrave MYH përgjatë PC2 në fibrat e kontrollit ishte e ngjashme me shpërndarjen e fibrave të marra nga analiza proteomike me 1000 fibra. Megjithatë, shumica e fibrave në pacientët me miopati nemaline zhvendosën poshtë PC2, duke u mbivendosur me fibra të shëndetshme me tkurrje të shpejtë, pavarësisht nga lloji i tyre i fibrave MYH native. Kështu, megjithëse pacientët me miopati nemaline ACTA1 treguan një zhvendosje drejt fibrave të tipit 1 kur u kuantifikuan duke përdorur metoda të bazuara në MYH, si miopatia nemaline ACTA1 ashtu edhe miopatia nemaline TNNT1 zhvendosën proteomën e fibrave të muskujve skeletorë drejt fibrave me tkurrje të shpejtë.
Pastaj krahasuam drejtpërdrejt secilin grup pacientësh me kontrolle të shëndetshme dhe identifikuam përkatësisht 256 dhe 552 proteina të shprehura në mënyrë të ndryshme në miopatitë nemalinike ACTA1 dhe TNNT1 (Figura 6E–G dhe Figura plotësuese 11C, Seti i të Dhënave plotësuese 21). Analiza e pasurimit të gjeneve zbuloi një rënie të koordinuar të proteinave mitokondriale (Figura 6H–I, Seti i të Dhënave plotësuese 22). Çuditërisht, pavarësisht mbizotërimit diferencial të llojeve të fibrave në miopatitë nemalinike ACTA1 dhe TNNT1, kjo rënie ishte plotësisht e pavarur nga lloji i fibrave të bazuara në MYH (Figura 6H dhe Figurat plotësuese 11D–I, Seti i të Dhënave plotësuese 23). Tre proteina mikrobike u rregulluan gjithashtu në miopatitë nemalinike ACTA1 ose TNNT1. Dy nga këto mikroproteina, ENSG00000215483_TR14_ORF67 (e njohur edhe si LINC00598 ose Lnc-FOXO1) dhe ENSG00000229425_TR25_ORF40 (lnc-NRIP1-2), treguan bollëk diferencial vetëm në miofibrat e tipit 1. ENSG00000215483_TR14_ORF67 është raportuar më parë se luan një rol në rregullimin e ciklit qelizor. 56 Nga ana tjetër, ENSG00000232046_TR1_ORF437 (që korrespondon me LINC01798) u rrit në miofibrat e tipit 1 dhe tipit 2A në miopatinë ACTA1-nemaline krahasuar me kontrollet e shëndetshme (Figura Plotësuese 12A, Seti i të Dhënave Plotësuese 24). Në të kundërt, proteinat ribozomale nuk u prekën kryesisht nga miopatia nemalinike, megjithëse RPS17 u ul në miopatinë nemalinike ACTA1 (Fig. 6E).
Analiza e pasurimit zbuloi gjithashtu një rritje të proceseve të sistemit imunitar në miopatitë nemalinike ACTA1 dhe TNNT1, ndërsa ngjitja qelizore u rrit gjithashtu në miopatinë nemalinike TNNT1 (Figura 6H). Pasurimi i këtyre faktorëve jashtëqelizorë u reflektua nga proteinat e matricës jashtëqelizore që zhvendosën PCA në PC1 dhe PC2 në një drejtim negativ (domethënë, drejt fibrave më të prekura) (Figura 6J). Të dy grupet e pacientëve treguan shprehje të rritur të proteinave jashtëqelizore të përfshira në përgjigjet imune dhe mekanizmat e riparimit të sarkolemës, të tilla si aneksinat (ANXA1, ANXA2, ANXA5)57,58 dhe proteina e tyre ndërvepruese S100A1159 (Figurat plotësuese 12B-C). Ky proces është raportuar më parë se është rritur në distrofitë muskulore60, por, sipas njohurive tona, nuk është shoqëruar më parë me miopatitë nemalinike. Funksioni normal i këtij mekanizmi molekular është i nevojshëm për riparimin e sarkolemës pas dëmtimit dhe për bashkimin e miociteve të sapoformuara me miofibra58,61. Kështu, aktiviteti i shtuar i këtij procesi në të dy grupet e pacientëve sugjeron një përgjigje riparuese ndaj dëmtimit të shkaktuar nga paqëndrueshmëria e miofibrës.
Efektet e secilës miopati nemaline ishin të korreluara mirë (r = 0.736) dhe treguan mbivendosje të arsyeshme (Figurat Plotësuese 11A–B), duke treguar se miopatia nemaline ACTA1 dhe TNNT1 kanë efekte të ngjashme në proteomë. Megjithatë, disa proteina u rregulluan vetëm në miopatinë nemaline ACTA1 ose TNNT1 (Figurat Plotësuese 11A dhe C). Proteina profibrotike MFAP4 ishte një nga proteinat më të rritura në miopatinë nemaline TNNT1, por mbeti e pandryshuar në miopatinë nemaline ACTA1. SKIC8, një komponent i kompleksit PAF1C përgjegjës për rregullimin e transkriptimit të gjenit HOX, u ul në miopatinë nemaline TNNT1, por nuk u prek në miopatinë nemaline ACTA1 (Figura Plotësuese 11A). Krahasimi i drejtpërdrejtë i miopatisë së nemalinës ACTA1 dhe TNNT1 zbuloi reduktime më të mëdha të proteinave mitokondriale dhe rritje të proteinave të sistemit imunitar në miopatinë e nemalinës TNNT1 (Figura 6G–H dhe Figurat Plotësuese 11C dhe 11H–I). Këto të dhëna janë në përputhje me atrofinë/distrofinë më të madhe të vërejtur në miopatinë e nemalinës TNNT1 krahasuar me miopatinë e nemalinës TNNT1 (Figura 6A), duke sugjeruar që miopatia e nemalinës TNNT1 përfaqëson një formë më të rëndë të sëmundjes.
Për të vlerësuar nëse efektet e vëzhguara të miopatisë nemalinike vazhdojnë në të gjithë nivelin e muskujve, ne kryem një analizë proteomike masive të biopsive të muskujve nga i njëjti grup pacientësh me miopati nemalinike TNNT1 dhe i krahasuam ato me kontrollet (n = 3 për grup) (Fig. Plotësuese 13A, Seti i të Dhënave Plotësuese 25). Siç pritej, kontrollet ishin të lidhura ngushtë në analizën e komponentëve kryesorë, ndërsa pacientët me miopati nemalinike TNNT1 shfaqën ndryshueshmëri më të lartë ndërmostrash të ngjashme me atë të parë në analizën e fibrave të vetme (Fig. Plotësuese 13B). Analiza masive riprodhoi proteinat e shprehura në mënyrë të ndryshme (Fig. Plotësuese 13C, Seti i të Dhënave Plotësuese 26) dhe proceset biologjike (Fig. Plotësuese 13D, Seti i të Dhënave Plotësuese 27) të theksuara duke krahasuar fibrat individuale, por humbën aftësinë për të dalluar midis llojeve të ndryshme të fibrave dhe dështuan të merrnin parasysh efektet heterogjene të sëmundjes nëpër fibra.
Të marra së bashku, këto të dhëna tregojnë se proteomika me një miofibër të vetëm mund të sqarojë tiparet klinike biologjike që nuk janë të dallueshme nga metodat e synuara siç është imunoblottimi. Për më tepër, këto të dhëna nxjerrin në pah kufizimet e përdorimit vetëm të tipizimit të fibrave të aktinës (MYH) për të përshkruar përshtatjen fenotipike. Në të vërtetë, megjithëse ndërrimi i llojit të fibrave ndryshon midis miopative të nemalinës së aktinës dhe troponinës, të dyja miopatitë e nemalinës e shkëputin tipizimin e fibrave MYH nga metabolizmi i fibrave të muskujve skeletorë drejt një proteome muskulore më të shpejtë dhe më pak oksidative.
Heterogjeniteti qelizor është kritik që indet të përmbushin kërkesat e tyre të larmishme. Në muskujt skeletorë, kjo shpesh përshkruhet si lloje fibrash të karakterizuara nga shkallë të ndryshme të prodhimit të forcës dhe lodhjes. Megjithatë, është e qartë se kjo shpjegon vetëm një pjesë të vogël të ndryshueshmërisë së fibrave të muskujve skeletorë, e cila është shumë më e ndryshueshme, komplekse dhe shumëplanëshe sesa mendohej më parë. Përparimet teknologjike tani kanë hedhur dritë mbi faktorët që rregullojnë fibrat e muskujve skeletorë. Në të vërtetë, të dhënat tona sugjerojnë që fibrat e tipit 2X mund të mos jenë një nëntip i dallueshëm i fibrave të muskujve skeletorë. Për më tepër, ne identifikuam proteinat metabolike, proteinat ribozomale dhe proteinat e shoqëruara me qelizat si përcaktues kryesorë të heterogjenitetit të fibrave të muskujve skeletorë. Duke aplikuar rrjedhën tonë të punës proteomike në mostrat e pacientëve me miopati nematodike, ne demonstruam më tej se tipizimi i fibrave të bazuara në MYH nuk pasqyron plotësisht heterogjenitetin e muskujve skeletorë, veçanërisht kur sistemi është i shqetësuar. Në të vërtetë, pavarësisht nga lloji i fibrave të bazuara në MYH, miopatia nematodike rezulton në një zhvendosje drejt fibrave më të shpejta dhe më pak oksiduese.
Fibrat e muskujve skeletorë janë klasifikuar që nga shekulli i 19-të. Analizat e fundit të omikës na kanë lejuar të fillojmë të kuptojmë profilet e shprehjes së llojeve të ndryshme të fibrave MYH dhe përgjigjet e tyre ndaj stimujve të ndryshëm. Siç përshkruhet këtu, qasjet e omikës gjithashtu kanë avantazhin e ndjeshmërisë më të madhe për përcaktimin sasior të shënuesve të llojit të fibrave sesa metodat tradicionale të bazuara në antitrupa, pa u mbështetur në përcaktimin sasior të një shënuesi të vetëm (ose disa) për të përcaktuar një lloj fibre të muskujve skeletorë. Ne përdorëm rrjedha pune plotësuese transkriptomike dhe proteomike dhe integruam rezultatet për të shqyrtuar rregullimin transkriptues dhe post-transkriptues të heterogjenitetit të fibrave në fibrat e muskujve skeletorë njerëzorë. Ky rrjedhë pune rezultoi në dështimin për të identifikuar fibra të pastra të tipit 2X në nivelin e proteinave në vastus lateralis të grupit tonë të të rinjve të shëndetshëm. Kjo është në përputhje me studimet e mëparshme të fibrave të vetme që gjetën <1% fibra të pastra 2X në vastus lateralis të shëndetshëm, megjithëse kjo duhet të konfirmohet në muskuj të tjerë në të ardhmen. Mospërputhja midis zbulimit të fibrave pothuajse të pastra 2X në nivelin e mRNA-së dhe vetëm fibrave të përziera 2A/2X në nivelin e proteinave është e çuditshme. Shprehja e ARNi-së së izoformës MYH nuk është cirkadiane,67 duke sugjeruar që nuk ka gjasa ta kemi "humbur" sinjalin e fillimit të MYH2 në fibrat 2X në dukje të pastra në nivelin e ARN-së. Një shpjegim i mundshëm, megjithëse thjesht hipotetik, mund të jenë ndryshimet në stabilitetin e proteinave dhe/ose ARNi-së midis izoformave MYH. Në të vërtetë, asnjë fibër e shpejtë nuk është 100% e pastër për asnjë izoformë MYH, dhe është e paqartë nëse nivelet e shprehjes së ARNi-së së MYH1 në rangun 70-90% do të rezultonin në bollëk të barabartë të MYH1 dhe MYH2 në nivelin e proteinave. Megjithatë, kur merret në konsideratë i gjithë transkriptomi ose proteoma, analiza e grumbullimit mund të identifikojë me besim vetëm dy grumbullime të dallueshme që përfaqësojnë fibra të ngadalta dhe të shpejta të muskujve skeletorë, pavarësisht nga përbërja e tyre e saktë e MYH. Kjo është në përputhje me analizat që përdorin qasje transkriptomike me një bërthamë të vetme, të cilat zakonisht identifikojnë vetëm dy grumbullime të dallueshme mionukleare. 68, 69, 70 Për më tepër, megjithëse studimet e mëparshme proteomike kanë identifikuar fibra të tipit 2X, këto fibra nuk grumbullohen veçmas nga pjesa tjetër e fibrave të shpejta dhe tregojnë vetëm një numër të vogël proteinash me bollëk të ndryshëm krahasuar me llojet e tjera të fibrave bazuar në MYH. 14 Këto rezultate sugjerojnë që duhet të kthehemi te pikëpamja e fillimit të shekullit të 20-të për klasifikimin e fibrave muskulore, e cila i ndau fibrat muskulore skeletore njerëzore jo në tre klasa të dallueshme bazuar në MYH, por në dy grupe bazuar në vetitë e tyre metabolike dhe kontraktile. 63
Më e rëndësishmja, heterogjeniteti i miofibrës duhet të merret në konsideratë përgjatë dimensioneve të shumëfishta. Studimet e mëparshme të "omikës" kanë treguar në këtë drejtim, duke sugjeruar që fibrat e muskujve skeletorë nuk formojnë grumbuj diskretë, por janë të rregulluara përgjatë një vazhdimësie. 11, 13, 14, 64, 71 Këtu, ne tregojmë se, përveç ndryshimeve në vetitë kontraktile dhe metabolike të muskujve skeletorë, miofibrat mund të diferencohen nga karakteristikat që lidhen me ndërveprimet qelizë-qelizë dhe mekanizmat e përkthimit. Në të vërtetë, ne gjetëm heterogjenitet të ribozomës në fibrat e muskujve skeletorë që kontribuon në heterogjenitet të pavarur nga llojet e fibrave të ngadalta dhe të shpejta. Shkaku themelor i kësaj heterogjeniteti të konsiderueshëm të miofibrës, të pavarur nga lloji i fibrave të ngadalta dhe të shpejta, mbetet i paqartë, por mund të tregojë organizim të specializuar hapësinor brenda tufave të muskujve që i përgjigjen në mënyrë optimale forcave dhe ngarkesave specifike,72 komunikim të specializuar qelizor ose specifik të organeve me lloje të tjera qelizash në mikroambientin e muskujve73,74,75 ose ndryshime në aktivitetin e ribozomës brenda miofibrave individuale. Në të vërtetë, heteroplazmia ribozomale, qoftë nëpërmjet zëvendësimit paralog të RPL3 dhe RPL3L ose në nivelin e 2′O-metilimit të rRNA-së, është treguar se shoqërohet me hipertrofinë e muskujve skeletorë76,77. Zbatimet multi-omike dhe hapësinore të kombinuara me karakterizimin funksional të miofibrave individuale do të avancojnë më tej kuptimin tonë të biologjisë së muskujve në nivelin multi-omik78.
Duke analizuar proteomet e miofibrave të vetme nga pacientët me miopati nemalinike, ne gjithashtu demonstruam dobinë, efektivitetin dhe zbatueshmërinë e proteomikës së miofibrës së vetme për të sqaruar patofiziologjinë klinike të muskujve skeletorë. Për më tepër, duke krahasuar rrjedhën tonë të punës me analizën globale të proteomikës, ne ishim në gjendje të demonstronim se proteomika e miofibrës së vetme jep të njëjtën thellësi informacioni si proteomika globale e indeve dhe e zgjeron këtë thellësi duke marrë parasysh heterogjenitetin midis fibrave dhe llojin e miofibrës. Përveç ndryshimeve të pritura (megjithëse të ndryshueshme) në raportin e llojit të fibrave të vërejtura në miopatitë nemalinike ACTA1 dhe TNNT1 krahasuar me kontrollet e shëndetshme,19 ne gjithashtu vumë re rimodelim oksidativ dhe jashtëqelizor të pavarur nga ndërrimi i llojit të fibrave të ndërmjetësuar nga MYH. Fibroza është raportuar më parë në miopatitë nemalinike TNNT1.19 Megjithatë, analiza jonë mbështetet në këtë gjetje duke zbuluar gjithashtu nivele të rritura të proteinave të sekretuara jashtëqelizore të lidhura me stresin, të tilla si aneksinat, të përfshira në mekanizmat e riparimit sarkolemik, në miofibrat nga pacientët me miopati nemalinike ACTA1 dhe TNNT1.57,58,59 Si përfundim, nivelet e rritura të aneksinave në miofibrat nga pacientët me miopati nemalinike mund të përfaqësojnë një përgjigje qelizore për të riparuar miofibrat rëndë atrofike.
Edhe pse ky studim përfaqëson analizën më të madhe të omikës së të gjithë muskujve me një fibër të vetme të njerëzve deri më sot, nuk është pa kufizime. Ne izoluam fibrat e muskujve skeletorë nga një mostër relativisht e vogël dhe homogjene pjesëmarrësish dhe një muskul i vetëm (vastus lateralis). Prandaj, është e pamundur të përjashtohet ekzistenca e popullatave specifike të fibrave në të gjitha llojet e muskujve dhe në ekstremet e fiziologjisë së muskujve. Për shembull, nuk mund ta përjashtojmë mundësinë e një nëngrupi të fibrave ultra të shpejta (p.sh., fibra të pastra 2X) që shfaqen tek vrapuesit me shpejtësi të lartë dhe/ose atletët e forcës79 ose gjatë periudhave të mosaktivitetit muskulor66,80. Për më tepër, madhësia e kufizuar e mostrës së pjesëmarrësve na pengoi të hetonim ndryshimet gjinore në heterogjenitetin e fibrave, pasi raportet e llojeve të fibrave dihet se ndryshojnë midis burrave dhe grave. Për më tepër, ne nuk ishim në gjendje të kryenim analiza transkriptomike dhe proteomike në të njëjtat fibra muskulore ose mostra nga të njëjtët pjesëmarrës. Ndërsa ne dhe të tjerët vazhdojmë të optimizojmë analizat e qelizave të vetme dhe miofibrave të vetme duke përdorur analizën omike për të arritur një input ultra të ulët të mostrës (siç demonstrohet këtu në analizën e fibrave nga pacientët me miopati mitokondriale), bëhet e dukshme mundësia për të kombinuar qasjet multi-omike (dhe funksionale) brenda fibrave të vetme muskulore.
Në përgjithësi, të dhënat tona identifikojnë dhe shpjegojnë faktorët transkriptues dhe post-transkriptues të heterogjenitetit të muskujve skeletorë. Në mënyrë specifike, ne paraqesim të dhëna që sfidojnë një dogmë të gjatë në fiziologjinë e muskujve skeletorë të lidhur me përkufizimin klasik të llojeve të fibrave bazuar në MYH. Shpresojmë të ripërtërijmë debatin dhe në fund të fundit të rimendojmë kuptimin tonë të klasifikimit dhe heterogjenitetit të fibrave të muskujve skeletorë.
Katërmbëdhjetë pjesëmarrës kaukazianë (12 burra dhe 2 gra) pranuan vullnetarisht të merrnin pjesë në këtë studim. Studimi u miratua nga Komiteti i Etikës i Spitalit Universitar të Ghentit (BC-10237), u përputh me Deklaratën e Helsinkit të vitit 2013 dhe u regjistrua në ClinicalTrials.gov (NCT05131555). Karakteristikat e përgjithshme të pjesëmarrësve paraqiten në Tabelën Plotësuese 1. Pas marrjes së pëlqimit të informuar me gojë dhe me shkrim, pjesëmarrësit iu nënshtruan një ekzaminimi mjekësor para përfshirjes përfundimtare në studim. Pjesëmarrësit ishin të rinj (22-42 vjeç), të shëndetshëm (pa probleme mjekësore, pa histori duhani) dhe mesatarisht aktivë fizikisht. Marrja maksimale e oksigjenit u përcaktua duke përdorur një ergometër hap pas hapi për vlerësimin e aftësisë fizike siç është përshkruar më parë. 81
Mostrat e biopsisë muskulore u mblodhën në gjendje pushimi dhe në gjendje agjërimi tri herë, me një interval prej 14 ditësh. Meqenëse këto mostra u mblodhën si pjesë e një studimi më të madh, pjesëmarrësit konsumuan placebo (laktozë), një antagonist të receptorit H1 (540 mg fexofenadinë) ose një antagonist të receptorit H2 (40 mg famotidinë) 40 minuta para biopsisë. Ne kemi demonstruar më parë se këta antagonistë të receptorëve të histaminës nuk ndikojnë në gjendjen fizike të muskujve skeletorë në gjendje pushimi81, dhe nuk u vu re asnjë grupim i lidhur me gjendjen në grafikët tanë të kontrollit të cilësisë (Figurat Plotësuese 3 dhe 6). Një dietë e standardizuar (41.4 kcal/kg peshë trupore, 5.1 g/kg peshë trupore karbohidrate, 1.4 g/kg peshë trupore proteina dhe 1.6 g/kg peshë trupore yndyrë) u mbajt për 48 orë para çdo dite eksperimentale, dhe një mëngjes i standardizuar (1.5 g/kg peshë trupore karbohidrate) u konsumua në mëngjesin e ditës eksperimentale. Nën anestezi lokale (0.5 ml 1% lidokainë pa epinefrinë), biopsitë muskulore u morën nga muskuli vastus lateralis duke përdorur aspiratën perkutane të Bergström.82 Mostrat muskulore u futën menjëherë në RNAlater dhe u ruajtën në 4°C deri në diseksionin manual të fibrave (deri në 3 ditë).
Tufat e miofibrave të sapoizoluara u transferuan në një mjedis të freskët ARNlater në një enë kulture. Miofibrat individuale u disektuan më pas manualisht duke përdorur një stereomikroskop dhe piskatore të holla. Njëzet e pesë fibra u disektuan nga secila biopsi, duke i kushtuar vëmendje të veçantë përzgjedhjes së fibrave nga zona të ndryshme të biopsisë. Pas diseksionit, secila fibër u zhyt butësisht në 3 μl tampon lize (SingleShot Cell Lysis Kit, Bio-Rad) që përmbante enzima proteinazë K dhe DNase për të hequr proteinat dhe ADN-në e padëshiruar. Liza e qelizave dhe heqja e proteinave/ADN-së u iniciuan më pas me anë të një rrotullimi të shkurtër, rrotullimit të lëngut në një mikrocentrifugë dhe inkubimit në temperaturën e dhomës (10 minuta). Lizati u inkubua më pas në një ciklik termik (T100, Bio-Rad) në 37°C për 5 minuta, 75°C për 5 minuta dhe më pas u ruajt menjëherë në -80°C deri në përpunim të mëtejshëm.
Bibliotekat e ARN-së poliadeniluar kompatibël me Illumina u përgatitën nga 2 µl lizat miofiber duke përdorur QuantSeq-Pool 3′ mRNA-Seq Library Prep Kit (Lexogen). Metodat e hollësishme mund të gjenden në manualin e prodhuesit. Procesi fillon me sintezën e ADNc-së së fijes së parë me anë të transkriptimit të kundërt, gjatë së cilës futen identifikues unikë molekularë (UMI) dhe barkode i1 specifike për mostrën për të siguruar grumbullimin e mostrave dhe për të zvogëluar ndryshueshmërinë teknike gjatë përpunimit në rrjedhën e poshtme. ADNc-ja nga 96 miofibra më pas grumbullohet dhe pastrohet me sfera magnetike, pas së cilës hiqet ARN-ja dhe kryhet sinteza e fijes së dytë duke përdorur prajmera të rastësishëm. Biblioteka pastrohet me sfera magnetike, shtohen etiketa i5/i7 specifike për pishinën dhe amplifikohet PCR. Një hap përfundimtar pastrimi prodhon biblioteka kompatibël me Illumina. Cilësia e secilës pishinë biblioteke u vlerësua duke përdorur Kitin e Analizës së ADN-së me Fragmente të Vogla me Ndjeshmëri të Lartë (Agilent Technologies, DNF-477-0500).
Bazuar në kuantifikimin e Qubit, grupet u grupuan më tej në përqendrime ekuimolare (2 nM). Grupi që rezultoi u sekuencua më pas në një instrument NovaSeq 6000 në modalitetin standard duke përdorur Kit-in e Reagentëve NovaSeq S2 (1 × 100 nukleotide) me ngarkesë 2 nM (4% PhiX).
Tubacioni ynë bazohet në tubacionin e analizës së të dhënave QuantSeq Pool të Lexogen (https://github.com/Lexogen-Tools/quantseqpool_analysis). Të dhënat u demultipleksuan fillimisht me bcl2fastq2 (v2.20.0) bazuar në indeksin i7/i5. Leximi 2 u demultipleksua më pas me idemux (v0.1.6) bazuar në barkodin e mostrës i1 dhe sekuencat UMI u nxorën me umi_tools (v1.0.1). Leximet u shkurtuan më pas me cutadapt (v3.4) në raunde të shumëfishta për të hequr leximet e shkurtra (<20 në gjatësi) ose leximet që përbëheshin vetëm nga sekuencat e përshtatësit. Leximet u rreshtuan më pas me gjenomin njerëzor duke përdorur STAR (v2.6.0c) dhe skedarët BAM u indeksuan me SAMtools (v1.11). Leximet e dyfishta u hoqën duke përdorur umi_tools (v1.0.1). Së fundmi, numërimi i rreshtimit u krye duke përdorur featureCounts në Subread (v2.0.3). Kontrolli i cilësisë u krye duke përdorur FastQC (v0.11.9) në disa faza të ndërmjetme të tubacionit.
I gjithë përpunimi dhe vizualizimi i mëtejshëm bioinformatik u krye në R (v4.2.3), kryesisht duke përdorur rrjedhën e punës Seurat (v4.4.0). 83 Prandaj, vlerat individuale UMI dhe matricat e meta të dhënave u transformuan në objekte Seurat. Gjenet e shprehura në më pak se 30% të të gjitha fibrave u hoqën. Mostrat me cilësi të ulët u hoqën bazuar në një prag minimal prej 1000 vlerash UMI dhe 1000 gjenesh të zbuluara. Në fund të fundit, 925 fibra kaluan të gjitha hapat e filtrimit të kontrollit të cilësisë. Vlerat UMI u normalizuan duke përdorur metodën Seurat SCTransform v2, 84 duke përfshirë të gjitha 7418 tiparet e zbuluara, dhe ndryshimet midis pjesëmarrësve u regresuan. Të gjitha meta të dhënat përkatëse mund të gjenden në Setin e të Dhënave Plotësuese 28.
Koha e postimit: 10 shtator 2025